Кислотный гидролиз белка
Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты
Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографииСмесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.
Количественный анализ полученных фракций.нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.
2. Определение аминокислотной последовательности в белке
Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах
Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.
Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:
определение аминокислотного состава изучаемого белка;
аминокислотной последовательности в белке.
Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин. Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.
Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.
Вторичная структура образуется только при участии водородных связеймежду пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.
α-Спираль
пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.
В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате ?-спираль «стягивается» множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность ?-спирали. гидрофильность ?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.
?-Спиральная структура — наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования ?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.
Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование ?-спирали. К ним относят:
пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и ?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;
β-Складчатый слойСтруктура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой» Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.
 | Видео (кликните для воспроизведения). |
Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная ?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного ?-складчатог
9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу («клубок»). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:
ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина—дисульфидные мостики);
ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;
водородные связи;
гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.
Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно. Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как «структурные мотивы».
Все клетки любых организмов, как автотрофных так и гетеротрофных, способны осуществлять синтез белков — ведущее звено пластического обмена. В сложном и многоступенчатом процессе синтеза белка в живой клетке (то есть биосинтеза) будет рассмотрен лишь один этап: образование полипептидной цепи из отдельных аминокислот, каждая из которых занимает совершенно определенное место в молекуле белка.
В самом обобщенном виде их можно наложить следующим образом. В ядре клетки молекулами ДНК «записан» (закодирован — от слова код) порядок аминокислот в белке. Информация об этом порядке от ядерной ДНК передается на синтезирующуюся информационную РНК. Этот процесс называется транскрипцией. Информационная РНК в цитоплазме вступает в соединение с рибосомами. К рибосомам же из цитоплазмы поступают и аминокислоты. Их доставляет туда транспортная РНК. Информационная и транспортная РНК вместе жестко определяют последовательность аминокислот при их синтезе ферментами рибосомы в белковую молекулу. Эта передача кода информации с РНК на аминокислоты белковой молекулы называется трансляцией. После окончания синтеза белковая молекула отрывается от рибосомы и уходит через эндоплазматическую сеть в глубь клетки.
Рассмотрим теперь перечисленные этапы биосинтеза белка несколько подробнее.
В каждой молекуле ДНК закодирована последовательность аминокислот для многих десятков и сотен различных белков. Способ кодирования следующий: последовательность аминокислот в белковой молекуле определяется последовательностью нуклеотидов в молекуле ДНК. Но так как аминокислот, входящих в белки, 20, а нуклеотидов всего 4, то каждой аминокислоте соответствует не один нуклеотид, а определенное сочетание трех нуклеотидов, которое получило название триплета. Всего таких сочетаний (из 4 по 3) может быть 64, то есть даже значительно больше, чем аминокислот.
Сейчас уже расшифрованы коды для всех аминокислот, входящих в состав белков. Так, аминокислота цистеин кодируется в молекуле ДНК таким сочетанием нуклеотидов (триплетом): A—C—A1; аминокислота валин — триплетом C—A—A; аминокислота лейцин — триплетом A—A—C; аминокислота пролин — триплетом G—G—G.
Приняты следующие сокращения: A — аденин, G — гуанин, T — тимин, C — цитозин, U — урацил.
Поэтому если в какой-то части молекулы ДНК последовательность нуклеотидов будет:
C — A — A — A — C — A — A — A — C — G — G — G,
то тем самым этой частью молекулы ДНК кодируется следующее соединение аминокислот в белковой молекуле:
валин — цистеин — лейцин — пролин.
Поскольку длина молекулы ДНК намного превышает длину молекулы белка, то вдоль одной молекулы ДНК может быть закодирована последовательность аминокислот для многих молекул белков. Отрезок молекулы ДНК, несущий в себе информацию об одной молекуле белка, называется геном (подробнее об этом понятии смотрите главу «Генетика»). Совокупность всех молекул ДНК клетки заключает в себе информацию о строении всех белков, которые в состоянии синтезировать данный вид животного или растения.
Транскрипция (переписывание) кода информации о синтезе белка с молекул ДНК на молекулы информационной РНК происходит в процессе их синтеза.
Информационная РНК синтезируется в ядре. Как и в случае репликации молекул ДНК, информационная РНК синтезируется из нуклеотидов по принципу комплементарности. Матрицей такого синтеза служит молекула ДНК. Надо только учесть, что в РНК вместо тиминового нуклеотида (T) имеется урациловый (U). Поэтому при синтезе информационной РНК против A(ДНК) встанет U(РНК), против T(ДНК) — A(РНК), против G(ДНК) — C(РНК) и против C(ДНК) — G(РНК) Поэтому приведенный уже выше код для последовательности четырех аминокислот будет «переведен» с языка ДНК на язык информационной РНК следующим образом:
| валин цистеин лейцин пролин | —последовательность аминокислот |
| C — A — A — A — C — A — A — A — C — G — G — G | код этой последовательности в одной цепочке ДНК |
| G — U — U — U — G — U — U — U — G — C — C — C | транскрипция этой последовательности на молекулу информационной РНК |
Таким образом, одна и та же аминокислота (например, валин) в молекуле ДНК кодируется триплетом C—A—A, а после транскрипции на молекулы информационной РНК кодируется комплектарным триплетом G—U—U. Это закономерно вытекает из способа синтеза молекул информационной РНК. Завершив синтез, эти молекулы из ядра выходят в цитоплазму и вступают в контакт с рибосомами.
Местом синтеза белка служат рибосомы. Каждая из них как бы нанизывается на молекулу информационной РНК (рисунок 8) и, продвигаясь вдоль нее, «читает» план сборки молекулы белка, триплет за триплетом. Превращение этого плана в реальные молекулы белка осуществляется с участием еще одной нуклеиновой кислоты — транспортной РНК.
Рисунок. 8. Схема синтеза белка в рибосоме. 1 — рибосома, 2 — информационная РНК, 3 — транспортные РНК с аминокислотами, 4 — белокМолекулы транспортной РНК достаточно мелки — это короткие одинарные цепочки нуклеотидов. Каждая молекула транспортной РНК специфична только для какой-то одной аминокислоты, только ее она может доставить из цитоплазмы к месту «сборки» белка. Специфичность молекул транспортной РНК достигается ее строением: один конец короткой цепочки несет на себе триплет, соответствующий коду данной аминокислоты (например, для валина — C—A—A), а другой конец может химически соединяться только с этой же самой кислотой. Именно в такой паре (например, валиновая транспортная РНК и сам валин) они и попадают на рибосому. Если же в этот момент рибосома находится на «валиновом» триплете информационной РНК (G—U—U), то «валиновый» триплет свободного конца транспортной РНК (C—A—A) по принципу комплементарности тотчас присоединяется к информационной РНК. Так, место аминокислоты валин фиксируется как раз там, где оно было сначала закодировано в молекуле ДНК (триплетом C—A—A), потом — в молекуле информационной РНК (триплетом G—U—U) и, наконец, доставлено транспортной РНК с триплетом C—A—A.
Таким образом, пока рибосома движется вдоль по молекуле информационной РНК, разные транспортные РНК со своими аминокислотами присоединяются к информационной РНК. Ферментные системы рибосом последовательно отщепляют аминокислоты от транспортных РНК и соединяют их между собой в цепочку белковой молекулы. Освободившиеся транспортные РНК снова переходят в цитоплазму за следующими порциями аминокислот. Так создается специфичность белковой молекулы на уровне ее первичной структуры. Вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются как первичной ее структурой, так и рядом других условий.
Следует иметь в виду, что каждое из описанных звеньев биосинтеза катализируется определенными ферментами и снабжается энергией за счет молекул АТФ.
Даже очень схематично описанный процесс биосинтеза удивляет своей упорядоченностью. А если к этому добавить, что в живой клетке синтез одной молекулы белка длится всего 3—4 с и что одновременно в разных участках клетки осуществляются синтезы самых разных белков и вместе с тем идет масса других биохимических процессов, то закономерен вопрос: каким же способом все это регулируется? Не все конкретные пути регуляции открыла еще наука. Но она открыла главный принцип регуляции в живой клетке — авторегуляцию. Предельно простым ее случаем будет следующий. Если какой-то белок синтезирован в клетке в достаточном количестве, то его дальнейшему синтезу препятствует сам факт присутствия этого белка в клетке. Пока он не выведен из клетки (или не израсходован каким-то иным путем), он химически действует на белки-ферменты, принимающие участие в его синтезе как тормоз. Ферменты временно перестают действовать. Синтез приостановлен. Но вот белок израсходован. Тем самым его тормозящее действие на ферменты исчезло. И синтез вновь возобновляется.
Легко понять, сколь длительным и многотрудным был путь эволюции живых организмов, прежде чем была достигнута столь совершенная авторегуляция.
Эта статья также доступна на Білоруська, Český, Deutsche, English, Español, Suomalainen, Français, Italiano, 日本, Norsk, Polski, Portugues, Українська и 中國
| Видео (кликните для воспроизведения). |
Источники:
Приветствую Вас на нашем портале. Я Владимир Корнев. В настоящее время я уже более 4 лет работаю персональным тренером. Я считаю, что являюсь профессионалом в своей области, хочу подсказать всем посетителям сайта как решать разнообразные задачи.
Все материалы для сайта собраны и тщательно переработаны для того чтобы донести в удобном виде всю нужную информацию. Однако чтобы применить все, описанное на сайте всегда необходима ОБЯЗАТЕЛЬНАЯ консультация с профессионалами.
