Последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Предлагаем вашему вниманию статью на тему: "Последовательность аминокислот в полипептидной цепи" от профессиональных спортсменов, их тренеров и врачей. Статья будет полезна как новичкам, так и опытным спортсменам. Все вопросы можно задать в комментариях или на странице контактов.

Ферментативные методы. Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсини химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина. Также при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназа, которая также относится к классу сериновых протеиназ. Фермент имеет два максимума протеолитической активности при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

В распоряжении исследователей имеется также большой набор менее специфичных протеолитических ферментов (пепсин, эластаза, субтилизин, папаин, проназа и др.). Эти ферменты используются в основном при дополнительной фрагментации пептидов. Их субстратная специфичность определяется природой аминокислотных остатков, не только образующих гидролизуемую связь, но и более удаленных по цепи.

Химические методы.

1) среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромцианом по остаткам метионина (рис 7).

Реакция с бромцианом проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи. Получающийся на С-конце пептидов лактон гомосерина далее частично гидролизуется до гомосерина (HSer), в результате чего каждый пептидный фрагмент, за исключением С-концевого, существует в двух формах – гомосериновой и гомосеринлактоновой;

Последовательность аминокислот в полипептидной цепи 155

Рис. 7. Расщепление полипептидной цепи бромцианом
2) большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N-бромсукцинимид;
[1]

3) реакция тиолдисульфидного обмена. В качестве реагентов используют восстановленный глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол.

Читайте так же:  Действие l карнитина на организм человека

5. Определение последовательности пептидных фрагментов. На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на предыдущей стадии. Для этой цели обычно используют химический метод, разработанный Пером Эдманом. Расщепление по Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только N-концевой остаток пептида, а все остальные пептидные связи не затрагиваются. После идентификации отщепленного N-концевого остатка метка вводится в следующий, ставший теперь N-концевым, остаток, который точно так же отщепляется, проходя через ту же серию реакций. Так, отщепляя остаток за остатком, можно определить всю аминокислотную последовательность пептида, используя для этой цели всего одну пробу. В методе Эдмана вначале пептид взаимодействует с фенилизотиоционатом, который присоединяется к свободной α-аминогруппе N-концевого остатка. Обработка пептида холодной разбовленной кислотой приводит к отщеплению N-концевого остатка в виде фенилтиогидантоинового производного, которое можно идентифицировать хроматографическими методами. Остальная часть пептидной цени после удаления N-концевого остатка оказывается неповрежденной. Операция повторяется столько раз, сколько остатков содержит пептид. Таким способом можно легко определить аминокислотную последовательность пептидов, содержащих 10 — 20 аминокислотных остатков. Определение аминокислотной последовательности проводится для всех фрагментов, образовавшихся при расщеплении. После этого возникает следующая проблема – определить, в каком порядке располагались фрагменты в первоначальной полипептидной цепи.

Автоматическое определение аминокислотной последовательности. Крупным достижением в области структурных исследований белков явилось создание в 1967 г. П. Эдманом и Дж. Бэггом секвенатора – прибора, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматическое отщепление N-концевых аминокислотных остатков по методу Эдмана. В современных секвенаторах реализованы различные методы определения аминокислотной последовательности.

6. Расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом. Чтобы установить порядок расположения образовавшихся пептидных фрагментов, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи, устойчивые к действию предыдущего реагента. Каждый из полученных коротких пептидов подвергается последовательному расщеплению по методу Эдмана (так же, как на предыдущей стадии), и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность.

Читайте так же:  Жиросжигатели для похудения женщин список лучших

7. Установление первичной структуры полипептида с учетом перекрывающихся последовательностей фрагментов обоих расщеплений. Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.

Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, для того чтобы найти перекрывающиеся участки для всех пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а иногда и четвертый способ расщепления, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих полное перекрывание всех участков и установление полной последовательности аминокислот в исходной полипептидной цепи.

Видео (кликните для воспроизведения).

Ферментативные методы. Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсини химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина. Также при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназа, которая также относится к классу сериновых протеиназ. Фермент имеет два максимума протеолитической активности при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

В распоряжении исследователей имеется также большой набор менее специфичных протеолитических ферментов (пепсин, эластаза, субтилизин, папаин, проназа и др.). Эти ферменты используются в основном при дополнительной фрагментации пептидов. Их субстратная специфичность определяется природой аминокислотных остатков, не только образующих гидролизуемую связь, но и более удаленных по цепи.

Читайте так же:  Л карнитин для набора массы

Химические методы.

1) среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромцианом по остаткам метионина (рис 7).

Реакция с бромцианом проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи. Получающийся на С-конце пептидов лактон гомосерина далее частично гидролизуется до гомосерина (HSer), в результате чего каждый пептидный фрагмент, за исключением С-концевого, существует в двух формах – гомосериновой и гомосеринлактоновой;

Последовательность аминокислот в полипептидной цепи 155

Рис. 7. Расщепление полипептидной цепи бромцианом
2) большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N-бромсукцинимид;
[1]

3) реакция тиолдисульфидного обмена. В качестве реагентов используют восстановленный глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол.

5. Определение последовательности пептидных фрагментов. На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на предыдущей стадии. Для этой цели обычно используют химический метод, разработанный Пером Эдманом. Расщепление по Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только N-концевой остаток пептида, а все остальные пептидные связи не затрагиваются. После идентификации отщепленного N-концевого остатка метка вводится в следующий, ставший теперь N-концевым, остаток, который точно так же отщепляется, проходя через ту же серию реакций. Так, отщепляя остаток за остатком, можно определить всю аминокислотную последовательность пептида, используя для этой цели всего одну пробу. В методе Эдмана вначале пептид взаимодействует с фенилизотиоционатом, который присоединяется к свободной α-аминогруппе N-концевого остатка. Обработка пептида холодной разбовленной кислотой приводит к отщеплению N-концевого остатка в виде фенилтиогидантоинового производного, которое можно идентифицировать хроматографическими методами. Остальная часть пептидной цени после удаления N-концевого остатка оказывается неповрежденной. Операция повторяется столько раз, сколько остатков содержит пептид. Таким способом можно легко определить аминокислотную последовательность пептидов, содержащих 10 — 20 аминокислотных остатков. Определение аминокислотной последовательности проводится для всех фрагментов, образовавшихся при расщеплении. После этого возникает следующая проблема – определить, в каком порядке располагались фрагменты в первоначальной полипептидной цепи.

Читайте так же:  Лучшие витамины для женщин после 40

Автоматическое определение аминокислотной последовательности. Крупным достижением в области структурных исследований белков явилось создание в 1967 г. П. Эдманом и Дж. Бэггом секвенатора – прибора, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматическое отщепление N-концевых аминокислотных остатков по методу Эдмана. В современных секвенаторах реализованы различные методы определения аминокислотной последовательности.

6. Расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом. Чтобы установить порядок расположения образовавшихся пептидных фрагментов, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи, устойчивые к действию предыдущего реагента. Каждый из полученных коротких пептидов подвергается последовательному расщеплению по методу Эдмана (так же, как на предыдущей стадии), и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность.

7. Установление первичной структуры полипептида с учетом перекрывающихся последовательностей фрагментов обоих расщеплений. Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.

Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, для того чтобы найти перекрывающиеся участки для всех пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а иногда и четвертый способ расщепления, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих полное перекрывание всех участков и установление полной последовательности аминокислот в исходной полипептидной цепи.

Видео (кликните для воспроизведения).

Источники:

  1. Виилма, Лууле Диабет / Лууле Виилма. — М.: «Издательство АСТ», 2011. — 160 c.
  2. Еда наш друг. Еда наш враг. — Москва: Гостехиздат, 2011. — 432 c.
Читайте так же:  Какой l карнитин лучше выбрать?
Последовательность аминокислот в полипептидной цепи
Оценка 5 проголосовавших: 1

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here